钙离子Ca2+成像--RacPLCγ2显著增强了B细胞受体介导的Ca2+活动

在生物有机体内，钙离子传递了各种各样的胞内信号，这些信号几乎在每种类型的细胞中都存在，而且在很多方面都有非常重要的作用。在很多细胞活动的时候，胞内钙离子的浓度会显著升高。钙离子成像是利用钙离子特异染料，将细胞中的钙离子浓度通过荧光强度表现出来，从而达到检测细胞活动的目的。德国的科学家通过研究B细胞胞质中钙离子浓度来研究 Rho GTPase Rac 对于B细胞功能的重要影响，研究发现，RacPLCγ2可以通过增强胞浆内的Ca2+浓度来影响B细胞受体（BCR）发挥作用。

文中，研究人员用BCR和Ca2+分别处理DT40 Bcell，观测DT40B cell中钙离子的浓度变化。研究人员研究了在这样的处理下，Unmodified DT40 cells ( PLCγ2+/+), PLCγ2-/- cells，PLCγ2-/- cells stably expressing wild-type 这几种细胞的钙离子浓度变化，说明了PLCγ2，Ca2+和BCR之间的关系。

一.实验材料：

1.DT40 B细胞

2.Poly-L-Lysine          0.01%（w/v)

3.Fluo-4 AM             2μM

4.Pluronic F-127        0.02%（v/v）

5.RPMI 1640

1.Buffer B         20 mM Hepes/NaOH, pH 7.4；143 mM NaCl；6 mM KCl；1 mM MgSO4；5.6 mM glucose

6.CaCl2                1mM

7.六通道载玻片          无包被，德国ibidi公司，80601

图一：ibidi六通道载玻片，可见载玻片上有六个平行通道，可以做六组平行实验。或者用不同的样本。通道载玻片的特点是单通道容积很小，需要的试剂量只有30μl。其底部可以直接使用油镜，进行高分辨率成像，光学效果极佳。本文中，是使用共聚焦显微镜观测钙离子染料的荧光值。

实验步骤

1) 使用0.01%（w/v)的多聚L赖氨酸（Poly L-Lysine）对六通道载玻片进行包被

2) 单通道铺入3×105 DT40 B细胞，37℃,10%CO2环境中孵育45分钟待细胞贴壁。

3) 使用无细胞培养基，轻轻冲洗通道，移除未贴壁细胞（图二）。

图二：冲洗换液方法，蓝色代表新的无细胞培养基

4) 用RPMI 1640培养基加入2 μM fluo-4 AM, 0.02 % (v/v)Pluronic® F-127，加入通道中，孵育30分钟。

5) 用Buffer B冲洗两次细胞，可以用加入 BCR抗体 anti-IgM或 1 mM CaCl2做为刺激液。

6) 使用共聚焦显微镜观测数据。

实验结果

图三： 由图中曲线可以看出，在没有胞外Ca2+存在的时候，对BCR的刺激（加入 BCR抗体 anti-IgM）和B细胞中钙离子活动成比。而当有胞外Ca2+的时候（加入1mM CaCl2）胞外对于胞内钙离子的活动也有非常显著的影响，会随着Anti-IgM的升高，胞内钙离子浓度会降

低。