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【蛋白研究系列专题】-23| 靶向蛋白质组MRMHR /PRM——U盘里的数字化抗体

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【蛋白研究系列专题】-23| 靶向蛋白质组MRMHR /PRM——U盘里的数字化抗体

基因的产物——蛋白质,反应了生命活动正在发生的事情。蛋白质组成及含量变化的研究愈演愈烈。在蛋白质组学研究中,一方面,WB、ELISA这些依赖于抗体的检测方法,对抗体质量要求极高。另一方面,基因水平的表达与蛋白含量的变化相关性较差。这些传统的方法都给蛋白含量的分析带来了困难。在这个大时代背景之下,MRMHR/PRM堪称“质谱界的WB、定量金标准、U盘中的‘数字化抗体’”便应运而生。

MRMHR/PRM简介
PRM(平行反应监测, ParallelReaction Monitoring),靶向蛋白质组,是一种基于高分辨、高精度质谱的靶向定量技术,能够对目标蛋白质/肽段(以及含有修饰的肽段)进行选择性检测,从而实现对目标蛋白质/肽段的精准定量。借用听来的一个比喻来说,靶向蛋白质组扫描就像精准狙击,排除干扰,目标明确,每一枪直指目标。
其基本原理是:四级杆(Q)首先选出的目标肽段离子,进入碰撞室中打碎后,所有的碎片离子经过质量分析器产生一张高分辨的二级质谱图,通过提取其中的碎片离子信息即可实现目标肽段的定量。
MRMHR/PRM  VS  WB


技术特点
(1)灵敏度、重现性和准确度高,定量范围可达到5个数量级,定量重现性CV<10%, 相对误差<15%。
(2)与经典的Westernblot、ELISA 技术相比,不需要使用抗体,获得更为准确和重现的定量验证结果。
(3)在一个小时检测时间内可同时实现50个蛋白质的定量检测。
(4)MRMHR/PRM可直接检测二级所有离子,减少了子离子的挑选和优化过程。
应用范围
目标蛋白质/肽段相对或绝对定量,蛋白质翻译后修饰的定性定量研究。
(1)定量蛋白质组学(iTRAQ、label-free、SILAC)后,目标蛋白需验证
(2)要做WB,却苦于没有抗体
(3)有多个蛋白质需同时定量
(4)功能研究中涉及到蛋白质定量

在应用时,一方面,使蛋白质验证不再受制于商业化抗体,可以应用于多种非模式生物。另一方面,使抗体验证能够高通量的在大规模生物样本上进行,提高实验效率。
应用举例
(1)肽段相对/绝对定量
案例中使用靶向的SRM技术(与PRM思路操作基本一致),利用已知浓度内标肽段做标准曲线,实现未知样品中目标肽段的绝对定量。
(2)蛋白相对定量
文章利用标准蛋白和复杂生物样品,对PRM技术进行了细致地评估,并采用Scheduled方法提高检测通量,显示出PRM技术的巨大应用前景。
Reference:
Multiplexed, Scheduled, High-ResolutionParallel Reaction Monitoring on a Full Scan QqTOF
Instrument with Integrated Data-Dependentand Targeted Mass Spectrometric Workflows. Anal Chem 2015, 87(20): 10222-10229
(3)蛋白磷酸化修饰定量
文章中通过定量磷酸化蛋白质组学技术得到癌症病人样品中的蛋白磷酸化的变化,然后用PRM技术对挑出的目标蛋白磷酸化位点的变化进行更精准地定量和验证。
Reference:
Phosphoproteins in extracellular vesiclesas candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci

U S A 2017, 114(12): 3175-3180

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