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怎么研究miRNA对下游基因的作用?

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怎么研究miRNA对下游基因的作用?



转载自“美捷登”,文章版权归武汉美捷登生物有限公司所有。

美捷登Rocia
在过去的二十几年的时间里,对miRNA的研究呈现爆炸式的增长,miRNA从“生物垃圾”摇身一变成为“年度分子”,该领域的研究也成为近期最热门的生物学课题之一。研究miRNA,经常会涉及到miRNA和下游靶向基因互作,今天我们就为大家介绍一种常用于研究miRNA和下游靶向基因互作的技术——双荧光素酶实验
双荧光素酶实验原理
利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性,在萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)的上游的3’UTR区域插入待验证的靶序列,构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞,适当刺激或处理后裂解细胞,测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

海肾荧光素酶(Renilla luciferase或R-Luc)以腔肠素(coelenterazine)为底物,在氧分子存在的条件下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide,此过程中发出最强波长在465nm左右的生物荧光。R-Luc通常由固定组成型启动子驱动,在报告系统中作为校正input误差的内参信号。

在测量过程中,首先加入荧光素酶检测试剂Luciferase Assay Reagent II产生萤火虫荧光信号,测量萤火虫荧光素酶活性。定量萤火虫荧光强度之后,再在同一样品中加入Stop&Glo Reagent试剂,将上述反应淬灭,并同时启动海肾荧光素酶反应,进行第二次测量,称之为双荧光素酶报告基因实验。

研究miRNA的靶基因实验时,使用双荧光素酶质粒情况
两种荧光素酶分别位于两个载体上,一般会涉及到三种质粒:
报告基因质粒:用于插入miRNA靶序列
内参质粒:表达海肾荧光素酶
转录因子表达质粒:micRNA


两种荧光素酶位于同一个载体上, 现在的这类质粒比较有名的是Promega公司的pmirGLO质粒(见图1)。从图中可以看到海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶在同一个载体上。

图1. pmirGLO 载体
案例分享
题目:Loss of miR-26b-5p promotes gastric cancer progression via miR-26b-5p-PDE4B/CDK8-STAT3 feedback loop
期刊: Journal of Translational Medicine 1479-5876 7.4
实验目的: miR-26b-5p与细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)或磷酸二酯酶4B(PDE4B)之间的相关性
实验方法和结果
1)构建质粒
报告基因质粒:它用来插入miRNA靶序列,将野生型(WT)或者突变(MUT) CDK8/PDE4B 3’UTR序列克隆到pmirGLO载体中
转录因子表达质粒:miR-26b-5p 或NC
2)共转染。将上述质粒使用Lipofectamine™ 3000转染到HEK-293 T细胞。

图2. 共转miR-26b-5p或者对照和3′UTR-WT或3′UTR-MUT的双荧光素酶结果
3)检测。当miR-26b-5p在HEK-293 T细胞中过表达时,3′UTR-WT的荧光素酶活性测定显著降低,而对3′UTR-MUT的荧光素酶活性没有观察到显著影响


参考文献:
Xu T, Xie M, Jing X, Jiang H, Wu X, Wang X, Shu Y. Loss of miR-26b-5p promotes gastric cancer progression via miR-26b-5p-PDE4B/CDK8-STAT3 feedback loop. J Transl Med. 2023 Feb 3;21(1):77. doi: 10.1186/s12967-023-03933-x. PMID: 36737782; PMCID: PMC9898947.



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