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JHM陈少良:PeANN1可作为植物修复候选基因缓解镉胁迫

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[成果与文献分享]

JHM陈少良:PeANN1可作为植物修复候选基因缓解镉胁迫

 楼主| xuyue_2017 发表于 2021-1-5 15:10  
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NMT作为生命科学底层核心技术,是建立活体创新科研平台的必备技术。2005年~2020年,NMT已扎根中国15年。2020年,中国NMT销往瑞士苏黎世大学,正式打开欧洲市场。



基本信息
主题:PeANN1可作为植物修复候选基因缓解镉胁迫
期刊:Journal of Hazardous Materials
影响因子:9.038
研究使用平台:NMT重金属创新平台
标题:Populus euphratica annexin1 facilitates cadmium enrichment in transgenic Arabidopsis
作者:北京林业大学陈少良、张一南

检测离子/分子指标
Cd2+、Ca2+

检测样品
拟南芥(WT,Atann1, PeANN1-OE1, PeANN1-OE2)根分生区(距根尖200 μm根表上的点)


中文摘要

植物修复技术为重金属(heavy metal, HM)污染土壤和水体的修复提供了巨大的潜力。筛选和确定与HM吸收和运输有关的候选基因是通过基因工程改善植物修复的先决条件。本研究以镉(Cd)敏感型胡杨为材料,鉴定了一个促进Cd富集的膜联蛋白编码基因。用CdCl2(50-100 μM)处理12 h后, 胡杨细胞下调了annexin1 PeANN1)的转录水平。PeANN1与拟南芥Annexin1(AtANN1)同源,并且主要定位于质膜(PM)和细胞溶质。与野生型和Atann1突变体相比,PeANN1在拟南芥中过表达导致长期Cd胁迫(10 d, 50 μM)后植物的存活率和根长下降更为明显,这是由于根部Cd积累较多造成的。PeANN1转基因植株的根在镉激(30 min,50 μM)和短期胁迫(12 h,50 μM)下表现出增强的Cd2+内流传导。值得注意的是,PeANN1促进的Cd2+内流被钙渗透通道(CaPC)抑制剂(GdCl3)显著抑制,但被1 mM H2O2促进,表明Cd2+通过PM中的自由基激活的CaPCs进入根细胞。因此,PeANN1可以作为通过基因工程改善植物修复的候选基因。



离子/分子流实验处理方法

7日龄拟南芥幼苗,
① 分别在0、50 μМ CdCl2的MS液体培养基中12 h
② 用50 μМ CdCl2实时处理
③ 分别在0、50 μМ CdCl2的MS液体培养基中12 h,然后用1.0 mM H2O2实时处理
④ 分别在0、50 μМ CdCl2的MS液体培养基中12 h,之后在50 μM CdCl2存在下,用500 μM GdCl3对CdCl2处理的植物再进行30 min的预处理


离子/分子流实验结果

稳态Cd2+流速结果表明,短期(ST)CdCl2(50 μМ, 12 h)处理会导致所有测试根中明显的Cd2+内流(图1)。PeANN1转基因株系根的Cd2+流速率显著高于WT和Atann1(图1)。在存在Cd2+的情况下,典型的钙通道抑制剂GdCl3明显抑制了所有测试株系中Cd2+的内流(图1)。药理学结果表明,Cd2+内流在一定程度上是由PM中的CaPCs介导的
图1.CdCl2和GdCl3对WT、Atann1突变体和PeANN1转基因系中Cd2+稳态流速的影响
在过表达PeANN1的拟南芥中还检测了CdCl2引起的Cd2+实时流速。在所有测试株系中,镉实时胁迫(50 μМ CdCl2)会引起短暂的Cd2+内流(图2A)。PeANN1-OE1(133.7 pmol cm-2s-1)和PeANN1-OE2(126.9 pmol cm-2s-1)的Cd2+内流峰值显著高于WT(83.6 pmol cm-2s-1)和Atann1(54.4 pmol cm-2s-1, 图2B)。
图2. CdCl2对拟南芥根中Cd2+实时流速的影响
实时流速结果表明,在H2O2理(1.0 mM)后,所有根中Cd2+和Ca2+的内流速率明显增加,但随着H2O2的处理时间延长,Cd2+和Ca2+的内流速率逐渐降低(图3A, B)。然而,PeANN1-OE1和PeANN1-OE2根中Cd2+和Ca2+的内流速率的峰值明显高于WT和Atann1根的内流速率(图3C, D)。这些结果表明,H2O2能促进PeANN1转基因植株根中Cd2+和Ca2+的传导。
图3. H2O2对WT、Atann1突变体和PeANN1转基因系中Cd2+或Ca2+实时流速的影响


其他实验结果

  • 实时定量PCR分析显示,CdCl2处理显著降低了胡杨愈伤组织中PeANN1转录水平。
  • PeANN1的cDNA全长序列为951bp,编码一个有316个氨基酸的假定蛋白。
  • 系统发育分析表明,PeANN1与Gossypium barbaenseLavatera thuringiaca的附件蛋白高度同源。
  • PeANN1-GFP主要位于细胞质区域,与质膜(PM)标记FM4-64和内质网(ER)标记ER-CFP共定位,表明PeANN1可能在ER中产生,并通过分泌途径进入PM。
  • 在无镉条件下,PeANN1-OE1和PeANN1-OE2的植株生长与WT和Atann1的植株生长没有太大差异。然而,WT和PeANN1-转基因株系的存活率和根长在CdCl2处理10 d后有所下降。与WT相比,PeANN1-转基因株系对CdCl2的抑制更为明显。突变体Atann1在长期CdCl2胁迫后,根系生长减少较少,存活率没有下降。
  • CdCl2胁迫后,细胞Cd2+浓度显著增加。PeANN1-转基因株系表现出比WT根更高的荧光强度。Atann1突变体则保持了较低的Cd2+荧光强度。



结论

过表达PeANN1可以增强转基因拟南芥对Cd2+的富集。本研究建立了一个示意图模型,说明了PeANN1促进了Cd在转基因植物中的富集。如图4所示,据推测,PeANN1通过以下方式促进Cd的富集:(i)调节钙渗透通道的运输,(ii)插入膜中破坏膜双层的稳定性或作为ROS激活的钙渗透通道。通道电导率以及对钙和镉的选择性需要通过使用平面脂双层和膜片钳的电生理学检测来进一步了解。尽管镉的电导特性需要进一步研究,但根据本研究的实验结果,建议转化PeANN1基因以改善植物的修复作用。
图4.镉胁迫下PeANN1-促进转基因拟南芥Cd2+富集的示意图模型


测试液

Cd2+:0.05 mM CdCl2, 0.1 mM KCl, 0.05 mM CaCl2, pH 5.7
Ca2+:0.1 mM NaCl, 0.1 mM KCl, 0.2 mM CaCl2, pH 5.7

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